Bài 6: Phát triển kỹ thuật Multiplex Real-time PCR phát hiện đồng thời bốn gen kháng Colistintừ MCR-1 đến MCR-4

Tóm tắt

Mục tiêu: Thiết kế các bộ primer/probe đặc hiệu để có thể phát hiện đồng thời 4 gen kháng colistin từ mcr-1 đến mcr-4 bằng kỹ thuật Multiplex Real-time PCR. 
Phương pháp: Các trình tự DNA của các gen từ mcr-1 đến mcr-4 được phân tích bằng các phần mềm tin sinh học (Clustal Omega, BioEdit, Fast PCR) để thiết kế 4 bộ primer/probe đặc hiệu cho các gen tương ứng. Sau khi tối ưu hóa về nồng độ primer/probe, nồng độ MgCl2 và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật Multiplex Real-time PCR, chúng tôi đánh giá về độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật bằng cách so sánh với kỹ thuật Multiplex PCR do Yamaguchi và cộng sự đề xuất [3]. 
Kết quả: Kỹ thuật Multiplex Real-time PCR có độ ổn định rất cao, sự thay đổi về nồng độ primer/probe từ 0,2/0,08 đến 0,6/0,24 µM hay sự thay đổi về nồng độ MgCl2 từ 3,0 đến 5,0 mM hầu như không ảnh hưởng tới kết quả của phản ứng. Khi thử nghiệm với các mẫu chứng dương có nồng độ từ 100 đến 108 bản sao/phản ứng, kỹ thuật có thể phát hiện khi trong mẫu có từ 101 bản sao/phản ứng. Khi thử nghiệm với 60 chủng E. coli, kỹ thuật Multiplex Real-time PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu đều là 100,0%. 
Kết luận: Kỹ thuật Multiplex Real-time PCR phát hiện đồng thời 4 gen kháng colistin từ mcr-1 đến mcr-4 có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện của kỹ thuật là từ 101 đến 108 copies/phản ứng. Do đó, kỹ thuật có thể áp dụng trong chẩn đoán lâm sàng và giám sát sự lưu hành của vi khuẩn mang gen kháng colistin trong cộng đồng.